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银杏等五个特种工业原料林树种定向培育及加工技术

ttc.njfu.edu.cn   2014-3-21

组织鉴定单位:国家林业局科技司

鉴定时间:2012年 12月23日

完成单位:南京林业大学

中国林业科学研究院资源昆虫研究所

中国林业科学研究院经济林研究开发中心

扬子江药业集团有限公司

山东永春堂集团有限公司

江苏同源堂生物工程有限公司

主要完成人员:曹福亮、赵林果、杜红岩、汪贵斌、颜延和、段琼芬、吴彩娥、李旭东、

陈军华、张燕平、俞建国、郑   璐、张往祥、郁万文、徐  莉、苏建荣、

杨时宇、郑益兴、马李一、杨逢建、彭兴民、赵洪亮、袁珍虎、程水源、

邢世岩、杜兰英、李广平、赵一鹤、乌云塔娜、陈  颖、李  群、顾炜江、

周统建、王佳宏、杨小虎、李婷婷、范龚健、张旭晖、杨绍彬、傅建敏、

金晓玲、李  钦、程铁峰、丛  悦、董娟娥、于景华

成果简介及推广应用前景:

近十年来,南京林业大学组织中国林科院资源昆虫研究所、中国林业科学研究院经济林研究开发中心等单位,开展了“银杏、印楝、辣木、杜仲和红豆杉等5个特种工业原料林树种定向培育及加工技术”的协同攻关研究。重点对银杏、印楝、辣木、杜仲和红豆杉等5个工业原料林树种的种质资源遗传分析、良种选育、苗木繁殖和培育技术、资源优质丰产定向培育技术和高效加工利用技术等进行了系统、全面的协同攻关和深入研究。

1.建成了银杏、印楝、辣木、杜仲和红豆杉等5个工业原料林树种的种质资源库。从国内外收集了印楝种源23个、辣木种源4个、优良家系19个、杜仲优良品种40个、红豆杉种源17个,新增银杏种质资源160份,建立了各树种的种质资源圃、良种采穗圃和种子园620亩。

2.研究了银杏、印楝、辣木和红豆杉等种质资源的遗传多样性及银杏重要基因的克隆与功能。

(1)印楝种质资源遗传分析。采用形态学统计和扩增片断长度多态性(AFLP)方法,对4个印楝种源的形态差异和遗传多样性进行比较分析。利用RAPD分子标记,对引种于云南省元谋县和红河县的印楝种群进行父本分析。应用核型分析和SSR分子标记分析收集到的印楝属两种及其两个变异类型四种材料的亲缘关系。

(2)红豆杉种质资源遗传分析。对5个野生云南红豆杉群体的34个表型性状进行了测量、分析,同时对云南红豆杉紫杉醇含量性状关联RAPD标记和表型标记进行了筛选,发现了5条低含量群体的特异性条带,11个位点与树皮的紫杉醇含量显著相关,13个位点与3年生小枝的含量显著相关,59个位点与针叶的含量显著相关。为进一步深入筛选与紫杉醇含量相关的特异性标记,开发了11对云南红豆杉的SSR引物。

(3)辣木种质资源评价。采用传统实验手段与现代分子标记相结合,对我国引种栽培的辣木种群的花发育、开花式样、花期物候、访花昆虫种类、访花行为、访花频率进行了观察,运用石蜡切片、荧光染色、杂交指数、花粉-胚珠比、SSR分子标记方法,对辣木的繁育系统各组成部分进行了研究。

(4)银杏硬脂酸去饱和酶基因克隆及表达分析。首次从银杏叶中克隆到硬脂酸去饱和代谢过程中三个关键酶基因:硬脂酰-ACP去饱和酶(GbSAD)、内质网型△-12(ω-6)脂肪酸去饱和酶(GbFAD2)、质体型△-12(ω-6)脂肪酸去饱和酶(GbFAD6);初步鉴定3种基因的亚细胞结构定位;应用进化树分析了这三个基因的历史进化地位。利用4种不同温度6个不同时间对GbSAD、GbFAD2和GbFAD6基因的表达进行研究,确定了温度对3种基因的表达作用以及其在温度逆境下的作用,揭示该基因与温度胁迫的关系。

(5)银杏苯丙氨酸代谢途径相关基因克隆与功能分析。以叶用银杏家佛手为研究材料,采用同源克隆方法从银杏中分离与黄酮、木质素等积累相关的几个酶基因-类异黄酮还原酶相似蛋白基因(GbIRL1),二氢黄酮醇4-还原酶基因(GbDFRs),肉桂醇脱氢酶基因(GbCAD1)和肉桂酰辅酶A还原酶基因(GbCCRs)。在此基础上,开展了相应功能研究与表达分析。

(6)银杏FLS基因启动子克隆及序列分析。利用生物信息学方法,分析了FLS基因的启动子结构。结果表明,FLS 基因启动子中包含了3个MYB转录因子结合位点和9 个光信号应答位点,为确立银杏FLS 基因与CHI 基因间的共调控关系及揭示FLS 基因应答光信号的转录调控机制提供了分子基础。

(7)银杏叶中黄酮类代谢关键酶基因表达与黄酮含量之间的关系。在人工气候室中采用盆栽土培方法,研究了水分和温度对2年生银杏叶中黄酮含量、黄酮生物合成关键酶基因表达的影响及其相互关系。研究结果表明,一定的低温和土壤水分条件促进了银杏叶黄酮类化合物生物合成关键酶基因的表达,从而提高了黄酮类化合物的生物合成和积累量。

(8)银杏叶次生代谢产物的环境诱导机制及其调控。研究了干旱胁迫、光强处理和光质处理条件下2年生银杏苗生长规律和根、茎、叶中黄酮和萜内酯含量的年动态变化,同步测定了叶中次生代谢关键酶PAL活性,采用RT-PCR方法分析黄酮和萜内酯代谢过程中14个关键酶基因表达情况,从终产物、蛋白质、核酸3个水平探讨了银杏应对环境变化的过程和分子机制。

3.先后开展了印楝、辣木、银杏、红豆杉和杜仲等树种的良种选育工作。选育出了果用、叶用、外种皮用、花粉用的优良种源、品种(无性系或品系)48个。其中,银杏核用品种8个(71#、1#、62#、35#、52#、42#、15#、50#)、银杏叶用品种4个(42#、32#、51#、13#)、银杏外种皮用品种2个(16 号、38 号)、银杏花粉用品种5个(南雄02、泰兴01、天目01、南雄01、奉化01)、银杏观赏用家系4个(16#、19#、21#、24#)、银杏耐热品种3个(27#、31#、57#)、耐寒品种8个(16#、41#、36#、45#、19#、17#、38#、40#)、杜仲家系4个、辣木种源1个、印楝种源4个、红豆杉种源5个;申报银杏新品种保护权8个(核用品种4个、外种皮用品种2个、叶用品种2个),获银杏新品种保护权6个, 6个银杏品种(核用品种3个、外种皮用品种2个、观赏用品种1个)和6个杜仲品种通过了省级良种审定或认定。

4.系统开展了银杏、印楝、辣木、红豆杉和杜仲等5个树种的苗木快速繁殖技术研究,包括播种技术、扦插技术、嫁接技术、组织培养技术等,开展了光、水、肥等因子对苗木产量和质量的影响,为培养优质苗木和苗木的无性系化提供了技术支撑。

5.全面开展了5个树种的栽培区划、立地选择、密度效应、平衡施肥效应、林农复合经营(种间和种内竞争)、抗逆性等工业原料林定向培育关键技术研究,创新集成了银杏叶用林、银杏核用林、银杏花用园、印楝果用林、杜仲药用林和红豆杉药用林等特种工业原料林定向培育技术体系。

(1)建立了银杏核用园丰产栽培技术体系。选用南林果1、南林果2、南林果4、宇香、亚甜、佛香、大金果等良种;选择排水良好、土壤pH值6.5-7.5的立地条件;密度在11年生前保留42株/亩,最终密度控制在14株/亩;施肥量(不同地区有差异)在江苏泰州地区N为11.29~14.32kg/亩,P2O5 为13.59~15.99kg/亩,K2O为11.48~14.59kg/亩;复合经营模式为银杏+蚕豆+黄豆;有效防治病虫害。该技术体系的建立能使产量提高30%以上。

(2)建立了银杏叶用园定向培育技术体系。选育优良单株南林叶1、南林叶2、42号、32号、51号、13号等优良无性系;选择排水良好、土壤PH值6.5~7.5,远离污染源的造林地;栽植密度为2000-2500株/亩;施肥量(不同地区有差异)在江苏泰州地区N为15.06~19.10kg/亩、P2O5为18.12~21.32kg/亩、K2O为15.31~19.45kg/亩;采用截干萌芽矮化经营方式;复合经营模式为银杏+蚕豆+黄豆(24:5:10)。该技术体系的建立能使银杏叶产量提高25%以上,黄酮和内酯含量提高12.3%以上。

(3)建立了印楝工业原料林培育技术体系。选用YL07、YL08、YL9和IND03等种源;选择有效土层厚、排水良好的造林地;采用截干造林方式;造林密度167株/亩;施肥量N为9.13~12.12kg/亩、P2O5为11.25~13.35kg/亩、K2O为9.48~12.37kg/亩。辣木原料林培育技术体系:选用缅甸种源中优选出的优良家系;选择有效土层厚80㎝以上的壤土或砂壤土、排水良好的立地造林地;采用直播或植苗造林方式;造林密度110株/亩;在干热河谷典型土壤燥红土条件下施肥量N为10~15kg/亩、P2O5为12~15kg/亩、K2O为10~15kg/亩。该体系的建立能使印楝产量显著提高,如通过配方施肥使印楝树高生长提高1.1倍,产量提高36.5%。

(4)建立了杜仲雄花茶园栽培技术体系。选用仲雄1号等杜仲高产雄花优良无性系;选用土层深厚,排灌条件良好的造林地;定干高度0.4-1.0m;造林密度每亩83-333株;树高控制在2.0m-3.0m;优化施肥方案为氮肥0.917-0.952kg/株,磷肥1.470-1.6344kg/株,钾肥1.290-1.389kg/株,N、P、K的用量比例为N:P:K =1:1.66:1.43。

(5)建立了红豆杉工业原料林培育技术体系。选用云南红豆杉和南方红豆杉优良种源;选择有效土层厚、排水良好的造林地;采用红豆杉和喜树混交造林等方式;造林密度110-220株/亩;施肥量N为8.55-16.30kg/亩、P2O5为10.50-15.65kg/亩、K2O为8.45-15.80kg/亩。该技术体系的建立使得产量在原有基础上提高10%以上,紫杉醇含量提高了15%。

6.全面开展了银杏等重要树种资源综合开发加工利用关键技术的研究。

(1)银杏叶生物饲料添加剂制备工艺调控及养殖应用

① 银杏叶酵母培养物的制备技术。以银杏叶为主要原料,以筛选、驯化获得的抗银杏叶抑制物能力较强的产阮假丝酵母为菌株,利用发酵工程和酶工程技术进行生物转化。发酵基料中银杏叶占80%,蒸汽蒸料60min,冷发酵基料却至40℃左右,接入5%-10%液体种子,在底物含水量60%、初始pH值4.5-5.0、温度为28-30 ℃的条件下发酵48 h。在此基础上,进行产品的扩大试验,建立了中试生产工艺。

② 银杏叶饲用复合酶的制备技术。以银杏叶为主要原料,以筛选、驯化获得的抗银杏叶抑制物能力和产酶能力均较强的A. niger-nl为菌株,进行产品的扩大试验,建立中试生产工艺。发酵基料中银杏叶占80%,蒸汽蒸料60min,冷发酵基料却至40℃左右,接入2.5%-5.0%液体种子,在初始含水量为65 %,培养基初始pH值5.0,温度28-30℃的条件下发酵72h。在此基础上,进行产品的扩大试验,建立了中试生产工艺。

③ 在国内外率先开发出黄芪-银杏复合饲料添加剂制备技术,确立了原始的创新工艺。黄芪与银杏叶比例为1:4,含水率65%,发酵基料初始pH值5.5,以2.2%-3.0%蔗糖为碳源,3.3%-4.0%硫酸铵为氮源,接种量为7.4%-10%,在28-30℃条件下发酵48-60h。产品中产朊假丝酵母数达到26.5亿个/g,黄芪多糖、粗蛋白含量、总氨基酸含量分别提高了11.15%、70.02%和20.92%。

④ 风味酶的制备技术。在已有工作基础上,进一步对β-葡萄糖苷酶基因稀有密码子进行定向改造和多拷贝数的构建,不仅大幅度提高了目的蛋白的表达量,而且有效地改善了该酶的酶学性质。发酵罐中,诱导物诱导54h后酶的活力达到137.8μg /ml,是初发菌株的44.6倍。

(2)银杏苷元黄酮高效生物转化酶的研制及其应用技术体系

① 以提取的T. thermarum DSM 5069基因组DNA为模板进行PCR,克隆、表达、纯化,得到极耐糖苷酶的纯酶。

② 极耐热β-葡萄糖苷酶在95℃、pH 4.8的条件下酶活最高,该酶在温度70-100℃、pH 4.8-8.0的范围内,均保持较高的酶活,该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5 mol/L。

③ 该酶具有极强的耐热性能和特异性降解糖苷的能力。该酶在适宜的酶用量下,在90℃、pH 5.2、5%甲醇条件下30 min可以将99%糖苷转化为苷元。

(3)高纯度银杏黄酮类化合物分离提纯及银杏叶粉针剂生产技术体系

①以银杏叶为原料,通过乙醇提取、大孔树脂分离得到银杏叶提取物。

②利用配位化学方法脱除银杏叶提取物中酚酸毒副作用。从研究银杏烷基酚酸分子结构特点和致毒的根本原因入手,通过配位反应改变银杏烷基酚酸的结构,进而从分子水平上去除了银杏烷基酚酸的毒副作用。建立的提纯流程是:将金属盐(ZnCl2、CuAc2)与EGb直接配位反应,正己烷萃取,利用大孔树脂与配位反应相结合手段进一步提纯。

③以中药配伍方法脱除银杏叶提取物(EGB)中酚酸毒副作用。将银杏叶提取物(EGB)与抗氧化中药配伍以脱除酚酸毒副作用:即通过银杏提取物与黄芪、灵芝、五味子等中药按不同比例,在不同条件下配伍,测定酚酸在配伍后的提取液中的含量。结果表明,灵芝与银杏配伍后,能大幅度减少银杏中酚酸的含量。

④加入羟丙基-β-环糊精分散混匀,并以葡甲胺或碳酸氢钠调pH值至6-7,过滤;滤液以50000-150000 Da滤膜超滤,灭菌,冷冻干燥获得银杏叶冻干粉针剂;或采用无菌喷雾干燥,获得银杏叶粉针剂。银杏叶片制备工艺使浸膏中银杏总黄酮醇苷和萜类内酯达30%和10%以上(传统工艺仅为24%和5%),银杏酚酸降到5ppm以下,产品片重由主流的0.27g/片降到0.18g/片。

(4)银杏食品精深加工技术体系

①银杏果贮藏保鲜。以江苏地区主栽银杏果材料,研究了贮藏温度、包装材料和生物保鲜剂等因素对银杏果贮藏期间的生理生化及营养贮藏品质的影响,建立一套银杏果安全保鲜关键技术。在此基础上,应用电子鼻对不同贮藏保鲜袋和不同贮藏保鲜剂处理后的银杏果挥发性气味进行检测,并对获得的数据进行了分析,确立了银杏果贮藏保鲜关键技术。

②银杏产品研发。课题组以银杏果为原料,分别开发了白果蛋白饮料、白果酸奶、重塑白果、降血压白果、银杏挂面、银杏抗性淀粉、即食白果软罐头、白果开心果、银杏醋及醋饮料等相关银杏产品。其中,为高效利用白果资源,克服白果难贮藏、等外白果价格低的缺点,课题组开展了果实高效加工利用关键技术的研究,创新集成了银杏油和银杏蛋白质提取及纯化的三项关键技术体系:集成创新了超临界二氧化碳新技术分离萃取银杏油的加工技术和工艺;确立了澄清白果汁所用生物酶的种类、用量、酶解等工艺条件;银杏粉、银杏油、银杏蛋白粉及白果汁四种产品加工技术的有机集成和组装。项目通过关键技术的研发及相关技术的集成组装,银杏油得率由2%提高到4%,银杏种仁蛋白质提取率达75%,白果澄清汁透光率由12%提高到65.9%。

③银杏致敏、致毒与脱毒。课题组从银杏酚酸、4’-O-甲基吡哆醇和银杏致敏蛋白的角度,系统研究了银杏的致敏、致毒和脱毒机制。课题组从蛋白质的角度研究白果的过敏性,包括白果致敏蛋白的种类及性质、对各种理化处理及体外模拟降解试验的反应特性,研究其致敏特性;二是应用动物体内试验,对白果过敏蛋白进行分析,明确其在白果致过敏中的作用及致敏机理。在此基础上,建立了银杏酚酸提取分离纯化工艺,开发了银杏果的低敏化工艺,经该工艺处理后,银杏果的酚酸含量下降95%以上,此技术已经用于低敏化银杏产品的加工。

(5)银杏花粉生物破壁技术

花粉破壁技术一直制约着花粉所含的营养物质及活性成分的释放。花粉生物破壁技术核心内容之一就是高效低成本酶的制备及相关重要酶的组合。项目组在前期研究的基础上,重点开展了纤维素酶、木聚糖酶制备技术的深入研究,在相关基因克隆与高效表达方面取得了重大突破,特别是木聚糖酶的表达水平达到了国际先进水平。通过对xynB基因进行优化并人工合成,在Pichia pastoris GS115中实现高效表达。摇瓶最高酶活力达到1408 IU/mL。在3 L发酵罐中进行高密度发酵,蛋白表达量达到0.584 mg/mL,最大酶活力达到20424.2 IU/mL。

(6)银杏大三元生物有机肥的研制与应用研究    

深入研究了不同银杏残叶添加比例的各处理堆肥温度的动态规律及差异、不同银杏残叶添加比例的各处理堆肥pH的动态规律及差异、不同银杏残叶添加比例的各处理堆肥全氮(TN)的动态规律及差异、不同银杏残叶添加比例的各处理堆肥有机碳(TC)的动态规律及差异,建立了不同银杏残叶添加比例的各处理堆肥腐熟度指标及评价,采用田间小区试验方法,研究了不同银杏残叶添加比例的堆肥及施用量对辣椒产量和土壤性质的影响作用。结果表明,不同银杏残叶添加比例的各处理堆肥对辣椒产量均具有一定增产作用,其中,添加20%的银杏残叶堆肥增产效果最明显。当施用量为22500Kg/hm2时,辣椒产量最高,与对照相比,增加了近2倍。

7.印楝资源综合开发利用技术体系

(1)印楝等植物生物活性物质加工一体化技术体系

该项技术最大特点是将破碎、筛分、提取3套设备合为1套,4道工序合为1道。快速萃取技术的印楝素浸膏提取率高达6.86%(而常规溶剂法仅3.80%),出油率大于30%,萃取时间8h(而常规溶剂法72h)。

(2)印楝素分离纯化和检测新技术体系

本课题组率先将闪色谱和高效毛细管电泳技术用于印楝素快速分离纯化和检测。该分离纯化技术降低了分离压力和缩短了分离时间,具有简单、快速、安全、成本低的显著特征。与目前通用的制备型HPLC相比,成本可降低约30%以上。该检测技术与传统的HPLC相比,分析时间短(仅需8分钟,HPLC需要60分钟),溶剂用量少 (仅为HPLC的1/10),操作简单易行,分析结果与HPLC法相比无显著性差异。

(3)生产印楝素干粉的配套技术

为了克服印楝素浸膏不稳定,不方便保存、运输和应用等问题,项目组集成创新了沉淀-Flash分离法和印楝素干粉生产的工艺条件。该项技术与同类技术相比,印楝素的含量高达25%,提高了14.7%;印楝素干粉的得率高达66%,成本降低了30%左右;同时克服了印楝素干粉成胶黏团等问题。该技术为国际首创,重点进行了工艺条件的自主创新,为年产15万吨印楝素干粉的规模化生产企业提供了技术支撑。

8.辣木资源综合开发利用技术体系

(1)辣木油籽脱皮及仁皮分离新技术及配套装置

该技术将辣木油籽脱皮与分选2套装置合为1套,减少了粉尘污染和厂房占地面积。现已建成了封闭式辣木籽脱皮中试的成套生产线,处理量达50-100Kg/h,脱净率﹥95%,破碎率<5%。

(2)辣木油脱色技术

采用物理吸附脱色法对辣木油的脱色工艺条件进行研究,得到了辣木油脱色的最佳工艺条件。脱色后辣木油产品色度值平均为:黄、红、亮度分别为2.7、0.1、0,远远低于冷榨辣木油的颜色,可以满足不同应用领域的要求。

(3)辣木一体化净水技术

该项技术是以天然、无毒、无副作用、易于降解的辣木为净水剂,克服了化学净水剂对人体健康的损害。与化学净水剂相比,其净水成本可降低10%左右,原水浊度和除菌率达到世界卫生组织要求的饮用水标准。该项技术所采用的双层斜管沉淀技术提高了固体颗粒的沉降速度和程度;采用全封闭工程保证了出水的质量和安全性。

9.杜仲资源综合开发利用技术体系

(1)杜仲油的抗氧化保鲜技术

通过抗氧化剂的筛选及活性物质的配对,获得具有显著抗氧化作用的VC、VE,有效延长了杜仲油的保质期。

(2)杜仲雄花茶制作配方及加工工艺

课题组围绕杜仲雄花茶制作配方及加工工艺开展了研究。①发明了以天然植物杜仲雄花的雄蕊和雄花芽为原料,比例为9.5:0.5-5.5:4.5的雄花茶配方;②实现了杜仲雄花茶加工技术的优化集成,该项技术包括采集、杀青、揉捻、成型、烘干等工艺流程,即春季盛花期采集杜仲雄花,置0.1℃-5℃冷库内贮藏,空气相对湿度85%-98%,O2浓度5%-15%,CO2浓度1%-5%,在该条件下保鲜时间从3天延长到22天。优化后的杀青条件为温度为140℃-200℃,杀青40-60秒,在这适宜的条件下杀青率达到95.7%;③首次进行了杜仲雄花茶药理和毒理学研究,对其食品安全性等进行了系统评价。杜仲雄花茶对小鼠具有明显的耐疲劳、耐缺氧、抗衰老等作用,杜仲雄花茶水煎液可以增加由D-半乳糖引起的衰老小鼠的SOD,GSH-Px的活性,减少MDA的产生。杜仲雄花茶对小鼠具有显著的肝保护作用,CCl4造成小鼠肝损伤后,血清ALT、AST水平有极显著升高(P<0.01);各剂量的杜仲雄花茶水煎液均能够显著抑制小鼠血清 ALT、AST水平的升高。空白组ALT、AST分别为19.5,21.0;模型组ALT、AST分别为213.8,219.7;杜仲雄花组ALT、AST分别为 43.8,48.3。

党中央明确了21世纪我国林业在社会经济发展中的定位:在贯彻可持续发展战略中林业具有重要地位;在生态建设中林业具有首要地位;在西部大开发中林业具有基础地位;在应对气候变化中林业具有特殊地位。特种工业原料林在现代林业建设中起着极其重要的、不可替代的作用。因此,发展我国特种工业原料林具有广阔的空间和巨大的市场前景。另一方面,银杏、红豆杉、杜仲、辣木和印楝等特种经济树种含有特殊的药用成分或营养成分,这些天然的化学成分是医药、生物农药、化工、保健品等工业生产中不可缺少的生产原料。高值化加工技术的原始创新和集成创新与产业化研究,将有效突破产业发展中的主要技术瓶颈,显著提高林产品的附加值和林产品的国际竞争力。因此,本课题的各项成果,包括选育出的良种、集成的苗木繁殖技术体系,定向培育技术体系和综合加工技术体系,具有广阔的市场应用前景。

在下一步的研究工作中,课题组将在总结现有研究成果和经验的基础上,进一步加强协同创新,进一步加大优质原料林造林材料筛选、推广的力度,实现银杏、印楝、辣木、红豆杉和杜仲的良种化、产业化的跨越式发展。同时,进一步创新加工技术,扩大示范生产线的建设规模,推动我国工业原料林产业的发展和产业链的延伸。

 
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